RESUMO
Abstract This study aimed to investigate the influence of a three-dimensional cell culture model and bioactive glass (BG) particles on the expression of osteoblastic phenotypes in rat calvaria osteogenic cells culture. Cells were seeded on two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) collagen with BG particles for up to 14 days. Cell viability and alkaline phosphatase (ALP) activity was performed. Cell morphology and immunolabeling of noncollagenous bone matrix proteins were assessed by epifluorescence and confocal microscopy. The expressions of osteogenic markers were analyzed using RT-PCR. Mineralized bone-like nodule formation was visualized by microscopy and calcium content was assessed quantitatively by alizarin red assay. Experimental cultures produced a growing cell viability rate up to 14 days. Although ALP activity at 7 days was higher on BG cultures, cells on 3D and 3D+BG had an activity decrease of ALP at 14 days. Three-dimensional conditions favored the immunolabeling for OPN and BSP and the expression of ALP and COL I mRNAs. BG particles influenced positively the OC and OPN mRNAs expression and calcified nodule formation in vitro. The results indicated that the 3D cultures and BG particles contribute to the expression of osteoblastic phenotype and to differentiated and mineralized matrix formation.
Resumo O objetivo deste estudo foi investigar a influência do modelo de cultura celular tridimensional e das partículas de vidro bioativo (BG) sobre a expressão fenotípica de culturas de células osteogênicas da calvária de ratos. As células foram mantidas em culturas sobre superfícies colágenas bi-dimensionais (2D) e em géis de colágeno tridimensional (3D) com e sem partículas de BG até 14 dias. Foram avaliadas: viabilidade celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), morfologia celular e imunomarcação de proteínas da matriz não-colágena do osso através de epifluorescência e microscopia confocal. As expressões de marcadores osteogênicos foram analisadas utilizando RT-PCR. A formação de nódulos mineralizados foi visualizada através de microscopia e o conteúdo de cálcio foi avaliado quantitativamente pelo Alizarina Red. As culturas experimentais produziram uma taxa crescente de viabilidade até 14 dias. Embora a atividade ALP em 7 dias tenha sido maior em culturas com BG, as células em 3D e 3D+BG apresentaram uma diminuição da atividade ALP aos 14 dias. As condições tridimensionais favoreceram a imunomarcação para OPN e BSP e a expressão de mRNAs para ALP e COL I. As partículas de BG influenciaram positivamente a expressão do mRNAs para OPN e OC e a formação de nódulos calcificados in vitro. Os resultados indicaram que as culturas em 3D e partículas BG contribuíram para a expressão do fenótipo osteoblástico e para a diferenciação e formação de matriz mineralizada.
Assuntos
Animais , Materiais Biocompatíveis , Vidro , Osteoblastos/citologia , Osteogênese , Crânio/citologia , Fosfatase Alcalina/genética , Fosfatase Alcalina/metabolismo , Biomarcadores/metabolismo , Cálcio/metabolismo , Técnicas de Cultura de Células , Sobrevivência Celular , Colágeno Tipo I/genética , Colágeno Tipo I/metabolismo , Técnica Indireta de Fluorescência para Anticorpo , Perfilação da Expressão Gênica , Sialoproteína de Ligação à Integrina/metabolismo , Microscopia Confocal , Microscopia de Fluorescência , Osteoblastos/enzimologia , Osteoblastos/metabolismo , Osteopontina/metabolismo , Ratos Wistar , Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real , RNA Mensageiro/genética , Crânio/enzimologia , Crânio/metabolismo , Alicerces TeciduaisRESUMO
BACKGROUND: Tridaxprocumbens flavonoids (TPFs) are well known for their medicinal properties among local natives. Besides traditionally used for dropsy, anemia, arthritis, gout, asthma, ulcer, piles, and urinary problems, it is also used in treating gastric problems, body pain, and rheumatic pains of joints. TPFs have been reported to increase osteogenic functioning in mesenchymal stem cells. Our previous study showed that TPFs were significantly suppressed the RANKL-induced differentiation of osteoclasts and bone resorption. However, the effects of TPFs to promote osteoblasts differentiation and bone formation remain unclear. TPFs were isolated from Tridax procumbens and investigated for their effects on osteoblasts differentiation and bone formation by using primary mouse calvarial osteoblasts. RESULTS: TPFs promoted osteoblast differentiation in a dose-dependent manner demonstrated by up-regulation of alkaline phosphatase and osteocalcin. TPFs also upregulated osteoblast differentiation related genes, including osteocalcin, osterix, and Runx2 in primary osteoblasts. TPFs treated primary osteoblast cells showed significant upregulation of bone morphogenetic proteins (BMPs) including Bmp-2, Bmp-4, and Bmp-7. Addition of noggin, a BMP specific-antagonist, inhibited TPFs induced upregulation of the osteocalcin, osterix, and Runx2. CONCLUSION: Our findings point towards the induction of osteoblast differentiation by TPFs and suggested that TPFs could be a potential anabolic agent to treat patients with bone loss-associated diseases such as osteoporosis.
Assuntos
Animais , Camundongos , Osteoblastos/efeitos dos fármacos , Osteogênese/efeitos dos fármacos , Flavonoides/farmacologia , Diferenciação Celular/efeitos dos fármacos , Asteraceae/química , Osteoblastos/citologia , Osteoblastos/metabolismo , Crânio/citologia , Crânio/efeitos dos fármacos , Fatores de Transcrição/genética , Flavonoides/análise , Calcificação Fisiológica/efeitos dos fármacos , Osteocalcina/efeitos dos fármacos , Osteocalcina/genética , Regulação para Cima/genética , Proteínas Morfogenéticas Ósseas/metabolismo , Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase Reversa , Fosfatase Alcalina/efeitos dos fármacos , Fosfatase Alcalina/metabolismo , Subunidade alfa 1 de Fator de Ligação ao Core/genética , Subunidade alfa 1 de Fator de Ligação ao Core/metabolismo , Cultura Primária de Células , Fator de Transcrição Sp7 , Medicina Tradicional , Camundongos Endogâmicos C57BLRESUMO
Resultados de pesquisas prévias tem encontrado potencial aumentado para a consolidação de enxertos ósseos mediante desmineralização do material enxertado e/ou das superfícies de consolidação. Entretanto há carência de embasamento apoiado em evidências biológicas do benefício de tal procedimento. Para testar esta hipótese, o tecido ósseo da calvária de cobaias (Cavia porcellus) foi exposto ao condicionamento por ácido cítrico durante 15, 30, 90 e 180 segundos (grupos teste). Quarenta e cinco discos ósseos de três milímetros de diâmetro foram removidos dos animais, dos quais 36 foram condicionados com ácido cítrico pH 1 a 50% e nove não receberam condicionamento (grupo controle). Sobre nove discos de cada grupo foram cultivados pré-osteoblastos MC3T3-E1 durante 24, 48 e 72 horas (três discos de cada grupo em cada tempo). Análises da morfologia celular, do número de células aderidas sobre as superfícies e da área de cobertura destas superfícies por préosteoblastos foram realizadas à microscopia eletrônica de varredura. Observou-se aumento do número de células aderidas às superfícies com o tempo, independentemente de haver condicionamento ou de seu tempo de aplicação. Entretanto, essa diferença só foi estatisticamente significante intragrupos (p<0,05) e quando comparados os períodos de 24 e 72 horas de incubação. A área de cobertura das superfícies por células aumentou significantemente com o tempo somente nos grupos teste, também entre os períodos de incubação de 24 e 72 horas (p<0,01). O grupo controle apresentou-se com 50% ou menos de área de cobertura superficial em relação aos demais. A duração de aplicação do ácido não interferiu significantemente nesse parâmetro de avaliação, mas nos grupos 15 e 30, a área de recobrimento ósseo mais do que triplicou às 72 horas em relação às 24 horas (p<0,01), com cerca de 70% das superfícies cobertas por células, contra 30% no grupo controle. Conclui-se que a desmineralização óssea...
Results of previous research has found increased potential for the consolidation of bone grafts by demineralization of the graft material and / or areas of consolidation. However there is a lack of foundation supported by biological evidence of benefits from such procedures. To test this hypothesis, the bone tissue of the calvaria of guinea pigs (Cavia porcellus) were exposed to conditioning by citric acid for 15, 30, 90 and 180 seconds (test group). Forty-five bone disks measuring three millimeters in diameter were removed from the animals, of which 36 were conditioned with citric acid pH 1 to 50% and nine did not receive conditioning (control group). About nine disks in each group were pre-cultured with MC3T3- E1 osteoblasts for 24, 48 and 72 hours (three discs of each group at each time point). Analysis of cell morphology, number of cells attached on the surface and the coverage area of these surfaces by pre-osteoblasts were performed on scanning electron microscopy. There was na increase in the number of cells attached to surfaces over time, regardless of conditioning or application time. However, this difference was not statistically significant intra-group (p <0.05) when comparing the periods of 24 and 72 hours of incubation. The coverage area of the surfaces of cells increased significantly with time only in the test groups, also among the incubation periods of 24 and 72 hours (p <0.01). The control group presented with 50% or less of surface area coverage compared to the other. The duration of application of the acid did not affect significantly this parameter of evaluation, but in groups 15 and 30, the bonearea covered more than tripled from 24 to 72 hours (p <0.01), with about 70 % of the area covered by cells, versus 30% in the control group. It was concluded that bone demineralization in the studied conditioning times provides a substrate on which cells acquire pre-osteoblastic morphology compatible with...
Assuntos
Animais , Masculino , Cobaias , Crânio/citologia , Osteoblastos/fisiologia , Técnica de Desmineralização Óssea/métodos , Ácido Cítrico/química , Adesão Celular/fisiologia , Diferenciação Celular/fisiologia , Microscopia Eletrônica de Varredura , Movimento Celular/fisiologia , Propriedades de Superfície , Fatores de TempoRESUMO
O flúor é um elemento natural encontrado em diversas concentrações tanto na água como no solo. É considerado um nutriente benéfico quando presente em níveis ótimos. Apesar de ser utilizado como medicamento em pacientes com osteoporose, sendo capaz de aumentar a densidade óssea, sua eficácia na redução de fraturas ainda apresenta muitas controvérsias, e a exposição a altos níveis e por tempo prolongado, pode levar à fluorose esquelética. Dessa forma o objetivo deste trabalho foi estudar in vitro o efeito do flúor no processo de mineralização por osteoblastos de duas espécies de camundongos com maior e menor densidade óssea, C3H/HeJ (C3) e C57BL/6J (B6) respectivamente. Os osteoblastos isolados da calvária através da digestão enzimática de animais recém nascidos foram expostos a diferentes doses de NaF, e os resultados mostraram que B6 foi mais suscetível ao NaF, apresentando redução da área mineralizada a partir da dose de 10M, enquanto que com C3, a dose significativa foi a partir de 50M, demonstrando que os osteoprogenitores mais diferenciados de C3, são mais resistentes à ação inibitória do flúor. Os testes de unidades formadoras de colônias indicaram um aumento do número de colônias de osteoprogenitores e do número de nódulos mineralizados com a exposição ao NaF. A atividade da metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) também foi aumentada no período de 7 dias em B6 e reduzida nos períodos de 14 e 21 dias em C3, evidenciando que a ação da MMP-2 nestes osteoblastos estão acopladas de forma distinta a diferentes pontos de restrição durante a progressão da diferenciação celular. A dualidade das respostas ao flúor apresentadas pelos modelos experimentais indica que a influência da ação anabólica do flúor, depende do número de alvos em potencial (quantidade de osteoprogenitores presentes na calvária, de células mesenquimais presentes na medula), da atividade intrínseca destes osteoblastos e do estágio de maturação dessas células. Desta forma, a abordagem in vitro...
Fluoride is a natural element found at varying concentrations in drinking water as well as in soil and it is considered a beneficial nutrient at optimal levels. However, although it is well recognized that the fluoride therapy is effective in increasing bone density and it has been used as therapeutic agent to treat osteoporosis, the efficacy in fracture reduction is highly controversial, and exposure to high levels and prolonged time can lead to skeletal fluorosis. The purpose of this study was to investigate the in vitro effects of fluoride exposure during mineralization of two inbread strains, C3H/HeJ (C3) and C57BL/6J (B6), with high and low bone mass respectively. The osteoblasts isolated from newborn mouse calvaria were exposed to several fluoride doses, and the results showed that B6 was more susceptible to NaF, as a reduction in the mineralized area with 10M was already seen; while in C3, the significative dose was with 50 M, indicating that more differentiated osteoprogenitors cells of C3 are more resilient to inhibitory fluoride action. The colony forming unit assays indicate an increase of colony numbers of osteoprogenitors cells and mineralized nodules with NaF treatment. The MMP-2 activity was up-regulated after 7 days of NaF exposure in B6 e down-regulated after 14 and 21 days in C3, showing the distinct coupled action of MMP-2 in different restrictions point during development sequence. The bifasic nature of fluoride responses present by these experimental models indicate that the anabolic action of fluoride is associated to the number of the potential targets (numbers of calvarial osteoprogenitors cells, mesenchymal stem cells), the intrinsic osteoblast activity and the maturation stage of these cells. The cell culture systems can provide molecular and cellular insights, and have the prospective to disclose potential targets and/or better efficacy and safety profile.
Assuntos
Animais , Masculino , Feminino , Camundongos , Calcificação Fisiológica , Densidade Óssea , Flúor/farmacologia , Osteoblastos , Crânio/citologia , Metaloproteinases da Matriz/farmacologia , Fatores de TempoRESUMO
PURPOSE: To analyze bone repair process in Wistar rats' calvaria, with the use of two different biomaterials. METHODS: Forty two male Wistar rats were used, and four bicortical cranial cavities were created in each animal. The cavities were filled with: bioactive glass (BG); calcium sulfate barrier (CSB); bioactive glass covered with calcium sulfate barrier (BG/CSB); and autogenous blood clot (control). The animals were euthanized 7, 14, 21, 30, 60, 90, e 120 days after surgery. The scalps were removed and submitted to a routine process for histological preparation: staining with Haematoxylin and Eosin (HE). RESULTS: The BG was not completely resorbed; however, after 60 days, a decrease in size as well as a change in the morphological granule were observed. CSB was not observed in the last group (after 120 days). CONCLUSIONS: In Wistar rat calvaria bioactive glass, in an isolated form, negatively interfered in the bone repair process; the calcium sulfate barrier, in an isolated form, presented the capacity to maintain space, allowing the flow of osteogenic cells; the bioactive glass covered with calcium sulfate barrier association presented a better osteoconductive capacity when compared to isolated materials; calcium sulfate barrier was completely resorbed after 90 days; control cavities did not completely heal until 120 days after surgery.
OBJETIVO: Analisar o processo de reparo ósseo em calotas cranianas de ratos Wistar, frente ao uso de diferentes biomateriais. MÉTODOS: Foram quatro cavidades, bicorticais, nas calotas cranianas de quarenta e dois ratos Wistar machos. As cavidades foram preenchidas com: vidro bioativo (VB); barreira de sulfato de cálcio (BSC); vidro bioativo coberto com barreira de sulfato de cálcio (VB/BSC); coágulo sangüíneo (controle). Os animais foram mortos aos 7, 14, 21, 30, 60, 90 e 120 dias após a cirurgia. As calotas foram removidas e submetidas ao processo de rotina para confecções de lâminas coradas com Hematoxilina e Eosina (HE). RESULTADOS: O VB não foi totalmente reabsorvido, contudo, a partir dos 60 dias, observaram-se alterações no tamanho e forma dos grânulos. A BSC não foi observada no último grupo (120 dias). CONCLUSÕES: Em calotas cranianas de ratos Wistar, o vidro bioativo na forma isolada interferiu negativamente no processo de reparo ósseo. A barreira de sulfato de cálcio na forma isolada apresentou a capacidade de manutenção do espaço preenchido, permitindo a migração de células osteogênicas. A associação vidro bioativo coberto com barreira de sulfato de cálcio apresentou uma maior capacidade osteocondutora quando comparada aos materiais nas formas isoladas. A barreira de sulfato de cálcio foi totalmente reabsorvida após 90 dias; As cavidades utilizadas como controle não cicatrizaram completamente até o período de 120 dias.
Assuntos
Animais , Masculino , Ratos , Implantes Absorvíveis , Regeneração Óssea/fisiologia , Substitutos Ósseos/uso terapêutico , Sulfato de Cálcio/uso terapêutico , Crânio/cirurgia , Materiais Biocompatíveis , Regeneração Óssea/efeitos dos fármacos , Cerâmica , Teste de Materiais , Osteogênese/fisiologia , Ratos Wistar , Crânio/citologia , Crânio/fisiologiaRESUMO
A family of proteins, the bone morphogenetic proteins (BMPs), which promote osteoblast differentiation and bone mineralization, have recently been identified. One, BMP-7, has shown the ability to induce cartilage and bone formation processes. In this report, the possibility that other cell lines, to CHO cells, may also be available as host cells for the expression of hBMP-7 was validated. Recombinant human BMP (rhBMP) -7 was produced in COS-7 cells, as a processed mature disulfide-linked homodimer, with an apparent molecular weight of 36, 000. Examination of the expressions of the markers characteristic of osteoblast phenotypes showed that the rhBMP-7 specifically stimulated the inductions of alkaline phosphatase (ALP) (5-fold increase at 100 ng of rhBMP-7/ml), parathyroid hormone (PTH) -mediated intracellular cAMP production (4-fold increase at 100 ng of rhBMP-7/ml) and osteocalcin synthesis (5-fold increase at 100 ng of rhBMP-7/ml). In summary, the in vitro mineralization assay results provide evidence that the rhBMP-7 peptide, produced by COS-7 expression system, possesses intact biological activity. A similar pattern of biological activity was observed for the BMP-7 in COS-7 cells compared to the corresponding CHO cell expression system. Thus, these findings can be experimentally utilized for the production of rhBMPs for in vitro or in vivo studies.